洛匹那韦作为HIV蛋白酶抑制剂通常与其他抗艾滋病药物共同作用,是以HIV蛋白酶为靶点的类重要的抗艾滋病药物，同时对现在流行的新型冠状病毒有这抑制的作用'洛匹那韦其中微量杂质的存在既影响疗效又增加了毒副作用,必须将其限制在规定安全范围内。高效液相色谱法( HPLC)具有将不同物质分离后逐一定量分离分析能力在药品有关物质检测中发挥着越来越重要的作用,成为药品杂质控制中常用而有效的手段之一。
虽然HPLC法还可用于同时检测血液中洛匹那韦等多种药物含量[2-5]I,但洛匹那韦中有关物质及其含量检测多采用现有药典HPLC方法而美国药典( USP) ,欧洲药典(EP)以及世界卫生组织(WHO)中所给出的洛匹那韦中微量组分测定方法流动相配置相对繁琐运行时间较长,分别达150 min( USP) 、81 Imin( EP)和70 min( WHO)[6-8]
1、实验部分
材料与仪器:
洛匹那韦USP标样以及各杂质的标样;乙腈、磷酸二氢钾、85%正磷酸均为色谱纯;实验用水均来自纯水系统;供试样品来自研发实验室APS80-16A高效液相色谱仪配有柱温箱与自动进样器;二级管阵列检测器;
2、数据处理系统。
色谱条件
色谱柱: C8 250 m1mnx4.6mm ,5 μum;
流动相:( A) 0.02 mol/l磷酸二氢钾水溶液,用磷酸调pH值至2.5 0.45 μm尼龙滤膜过滤，超声除去溶液中的气泡;
( B)乙腈稀释剂:流动相A-乙腈=7:3流速:1 mL/min ,进样量:20 μL ,波长,210 n
梯度洗脱程序见表1
3、溶液配制
杂质贮备液:0.15 mg/mL杂质标样混合物,同时准备AB二个平行样。
标样贮备液:0.10 mg/mL洛匹那韦USP标准品同时准备AB二个平行样。
分离度测试溶液:50mg标样到50mL容量瓶，加入0.5 mL杂质储备液B稀释剂定容。
参比溶液:转移1 mL杂质贮备液A(B) ,1 mL标样储备液A( B)到100 mL容量瓶中稀释定容,同时准备2个平行样。样品溶液:准确称取50 mg供试品到50 mL容量瓶中用稀释剂溶解定容,并用0.45 μm的针头过滤器过滤后进样。
4、进样顺序
一、(1)空白;(2)分离度测试液;(3)空白;(4)参比溶液A;( 5)参比溶液B。
二、( 1)参比溶液B......B6(2)空白;( 3)样品溶液A;(4)样品溶液B;(5)空白;(6)参比溶液B;(7)空白
5、结果与讨论
色谱分离条件的选择与优化正文美国药典与世界卫生组织国际药典中均给
出洛匹那韦相关杂质检测方法本实验对色谱分离条件进行了系统优化。从色谱柱选择上考虑到美国药典中用到色谱250 mmx4.6 mm 5 μm ,国际药典中用到的是C18 250 mmx4.6 mm 5 μm本实验为了更有效的分离提纯和结晶等合成过程中产生的杂质,采用C8 250 mmx4.6 mm 5 μm所有杂质均可以呈现和分离。
首先固定梯度洗脱运行总时间与终止时流动相的比例,改变起始流动相的比例,将有机相从30%调节到80%。实验发现随着起始流动相中有机相比例的提高各杂质保留时间都有不同程度减少但是流出顺序没有发生改变但洛匹那韦样品主峰同主峰之前相对保留时间是0.95 ,左右的杂质分离度明显变小。因此实验选择起始流动相的有机相比例为30%。然后固定起始流动相和终止流动相比例改变梯度洗脱程序以考察各化合物的保留时间变化情况最后终决定采用65 min梯度洗脱程序。
6、准确度与精密度
首先称取10mg洛匹那韦标样在100mL容量瓶中溶解定容精确移液1 mL到100 mL容量瓶中, 再移液1 mL杂质贮备液到此容量瓶中并用稀释剂定容( A)同时配制另外一个完全相同的溶液( B)其中A或B单一样品重复进样6针按照下述公式；
为测试系统适应性本节配制的溶液A或B(0.001 mg/mL)根据药典要求其主峰理论塔板数应大于5 000拖尾因子小于2.0峰面积相对标准偏差RSD不大于2.0%保留时间的相对标准偏差不大于1.0%。根据我们优化的实验条件进行实验效果更佳:相似因子0.97 ~1.01;洛匹那韦主峰理论塔板数22451.25 ~27 351. 78;拖尾因子0.9127~0.9699;洛匹那韦主峰面积相对标准偏差RSD0.64% ~1. 74%;洛匹那韦主峰保留时间RRT的相对标准偏差0. 05% ~0. 06%。
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